Réactifs pour l'extraction d'ARN : rôle du Trizol et protocole
1. Introduction : pourquoi le Trizol ?
Lors de l'isolement et de l'extraction d'acides nucléiques de bactéries, qu'il s'agisse d'ARN bactérien total ou d'ADN, la qualité de l'ARN extrait dépend directement de l'efficacité de la lyse et de la protection contre les RNases. Le Trizol (ou TRI Reagent) est un réactif prêt à l'emploi qui combine une solution de phénol et d'isothiocyanate de guanidine, un puissant dénaturant protéique. Ce réactif maintient l'intégrité de l'ARN tout en perturbant les cellules et en dissolvant les membranes.
L'isothiocyanate de guanidine est un agent chaotrope qui dénature les protéines, y compris les RNases, assurant ainsi la stabilité de l'ARN. Le phénol acide (pH 4,5‑5,0) permet la séparation des phases : l'ARN reste dans la phase aqueuse, tandis que l'ADN et les protéines sont extraits dans la phase organique ou à l'interface. Ce réactif peut être acheté commercialement (TRIzol™, Invitrogen) ou préparé en laboratoire selon un protocole standardisé.
2. Composition du Trizol et préparation maison
Le réactif Trizol contient :
- Thiocyanate de guanidinium 4 M : dénaturant protéique et inhibiteur de RNases.
- Citrate de sodium 25 mM (pH 7,0) : tampon stabilisant le pH.
- N‑laurosylsarcosine 0,5 % (p/v) : détergent anionique pour la lyse membranaire.
- 2‑mercaptoéthanol 0,1 M : agent réducteur protégeant les liaisons disulfures.
Pour une préparation maison, on dissout 250 g de thiocyanate de guanidinium dans 17,6 mL de citrate de sodium 0,75 M (pH 7,0) et 26,4 mL de N‑laurosylsarcosine à 10 % (p/v). La solution est conservée à température ambiante pendant moins de 3 mois. Avant chaque utilisation, ajouter du 2‑mercaptoéthanol frais (0,1 M final).
3. Protocole d'extraction d'ARN avec Trizol
- Culture bactérienne : cultiver les bactéries dans un milieu LB jusqu'à la phase exponentielle (OD600 ~0,5‑1,0).
- Centrifugation : récupérer le culot cellulaire par centrifugation (6000 tr/min, 5 min). Laver une fois avec du PBS stérile.
- Lyse au Trizol : remettre le culot en suspension dans 1,5 mL de Trizol par gramme de culot (ou 1 mL pour 10⁷‑10⁸ cellules).
- Incubation : incuber 5 min à température ambiante pour dissocier les complexes nucléoprotéiques.
- Ajout de chloroforme : ajouter 0,2 mL de chloroforme par 1 mL de Trizol, agiter vigoureusement 15 s, incuber 2‑3 min à température ambiante.
- Centrifugation : centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 °C. Trois phases apparaissent : phase aqueuse (ARN), interphase (ADN), phase organique (protéines).
- Récupération de la phase aqueuse : transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube sans toucher à l'interphase.
- Précipitation de l'ARN : ajouter 0,5 volume d'isopropanol (ou 1 volume d'éthanol 100 %), incuber 10 min à température ambiante, centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 °C.
- Lavage : laver le culot avec 1 mL d'éthanol 75 % (préparé avec de l'eau DEPC), centrifuger, éliminer l'éthanol.
- Séchage et resuspension : sécher le culot à l'air libre, puis le dissoudre dans 50‑100 µL d'eau DEPC ou de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8).
- Contrôle qualité : mesurer la concentration par spectrophotométrie (A260/A280 ≥ 1,8) et visualiser l'intégrité sur gel d'agarose (bandes 23S et 16S pour les bactéries).
Le rendement typique est de 10‑20 µg d'ARN total pour 10⁸ cellules. L'ARN extrait peut être utilisé pour la RT‑PCR, le séquençage d'ARN ou les analyses de transcriptome.
4. Rôle des tampons associés : TE et autres
Le tampon TE (Tris‑EDTA) est fréquemment utilisé pour la resuspension finale de l'ARN. Le Tris assure un pH stable (8,0) et l'EDTA chélate les ions Mg²⁺, inhibant les nucléases résiduelles. Pour les étapes de lavage, on utilise de l'éthanol 70‑75 % préparé avec de l'eau traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate) pour éliminer les sels et les traces de phénol.
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