Quantification et dosage de l'ARN pour RT‑PCR : méthodes et interprétation
1. Pourquoi quantifier l’ARN après extraction ?
La quantification et le dosage des acides nucléiques, y compris l'ARN (Acide ribonucléique), est l'étape la plus importante et la plus nécessaire après l'achèvement de la pratique d'extraction des acides nucléiques (ADN ou ARN). L'extraction des acides nucléiques se fait toujours par lyse cellulaire qui libère l'ADN ou l'ARN dans le milieu d'extraction. L'analyse qualitative et quantitative de l'extraction de l'ARN est essentielle après chaque extraction car la qualité de l'ADN ou de l'ARN pourrait affecter les résultats de la PCR.
La PCR est une technique de biologie moléculaire appliquée dans tous les laboratoires de biologie moléculaire et consiste à amplifier des fragments de l'ADN cible par exemple l'ARN 16S des bactéries. Dans le cas de l'ARN, on utilise une RT-PCR qui retranscrit l'ARN par transcriptase inverse en ADN avant l'étape d'amplification par l'enzyme polymérase (Taq polymérase). La qualité de l'acide nucléique extrait peut être prédite par spectrophotométrie UV-Vis (NanoDrop) ou par électrophorèse sur gel d'agarose.
2. Méthodes de quantification : spectrophotométrie UV‑Vis (NanoDrop)
La méthode traditionnelle d'évaluation de la concentration et de la pureté de l'ARN est la spectroscopie UV-Vis. Dans cette technique, l'absorbance d'un échantillon d'ARN dilué est mesurée à 260 et 280 nm, et la concentration en acide nucléique est calculée à l'aide de la loi de Beer‑Lambert.
3. Loi de Beer‑Lambert et calcul de concentration
La loi de Beer‑Lambert relie l'absorbance (A) à la concentration (C) d'un composé absorbant dans une solution :
- A = absorbance à une longueur d'onde donnée
- C = concentration d'acide nucléique
- l = trajet optique de la cuvette (généralement 1 cm)
- ε = coefficient d'extinction molaire (pour l'ARN, ε = 0,025 (µg/mL)⁻¹cm⁻¹)
Ainsi, une absorbance A260 de 1,0 correspond à environ 40 µg/mL d'ARN (pour l'ADN double brin, 50 µg/mL ; pour les oligonucléotides, 33 µg/mL). Le NanoDrop utilise ce principe avec un trajet optique très court (0,5 mm) pour mesurer des échantillons de 1‑2 µL sans dilution.
4. Interprétation des ratios de pureté (A260/A280)
Le rapport A260/A280 est utilisé pour évaluer la pureté de l'ARN. Un ratio compris entre 1,8 et 2,1 indique un ARN hautement purifié. Des valeurs plus basses peuvent signaler une contamination par des protéines (absorbance à 280 nm) ou par des phénols résiduels. Il est important de noter que ce ratio dépend du pH et de la force ionique du solvant :
- Eau traitée au DEPC (pH 5‑6) : ratio ≈ 1,60
- Eau exempte de nucléase (pH 6‑7) : ratio ≈ 1,85
- Tampon TE (pH 8,0) : ratio ≈ 2,14
Il est donc recommandé de mesurer l'absorbance dans le même tampon que celui utilisé pour la resuspension finale de l'ARN.
5. Limites de la spectrophotométrie et alternatives
La spectrophotométrie UV-Vis ne distingue pas l'ARN intact de l'ARN dégradé ni des contaminants comme le sel ou les carbohydrates. Pour une évaluation plus précise, on utilise souvent des fluoromètres (Qubit) qui utilisent des colorants fluorescents spécifiques à l'ARN (ou à l'ADN) et ne détectent que les acides nucléiques intacts. L'intégrité de l'ARN est quant à elle évaluée par électrophorèse sur gel ou par analyse sur BioAnalyzer (RIN – RNA Integrity Number).
6. Impact de la qualité de l'ARN sur les applications aval
Une mauvaise qualité d'ARN (dégradé ou contaminé par des protéines) peut inhiber la transcriptase inverse et réduire l'efficacité de la RT‑PCR. Un ARN de bonne qualité est essentiel pour les études d'expression génique, le séquençage de transcriptomes (RNA‑seq) et la détection de pathogènes. Il est donc crucial d'optimiser l'extraction et le dosage pour garantir des résultats fiables.
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