Extraction de l'ARN total des bactéries : méthodes, rôles et précautions
1. Introduction : les ARN bactériens et leurs rôles
Le dogme central de la vie suggère que l'ADN héberge toutes les informations codant pour les protéines, via l'ARN. Chez les bactéries, l'ARN remplit de nombreuses fonctions :
- Agit comme catalyseur pour certaines réactions biochimiques (ribozymes).
- Est le porteur d'acides aminés lors de la synthèse des protéines (ARNt).
- Transmet l'information génétique de l'ADN vers les ribosomes (ARNm).
- Sert de modèle pour la synthèse protéique (ARNm).
L'ARN est donc une macromolécule omniprésente qui joue des rôles cruciaux dans le codage, le décodage, la régulation et l'expression des gènes.
On distingue plusieurs types d'ARN chez les procaryotes : l'ARN messager (ARNm), l'ARN de transfert (ARNt), l'ARN ribosomal (ARNr 5S, 16S, 23S) et les petits ARN (sRNA) régulateurs comme l'ARN 6S chez E. coli. Ce dernier inhibe l'ARN polymérase en période de stress, induisant la phase stationnaire. L'ARNtm (ou ARN de transfert-messager) est un hybride qui marque les protéines incomplètes pour dégradation.
2. Principe de l'extraction d'ARN par Trizol
La méthode la plus répandue pour extraire l'ARN total de bactéries est l'utilisation du réactif Trizol (développée par Chomczynski et Sacchi en 1987). Ce réactif monophasique contient du phénol et de l'isothiocyanate de guanidine, un puissant dénaturant qui inactive les RNases et dissout les membranes cellulaires.
Après homogénéisation, l'ajout de chloroforme provoque une séparation de phases :
- Phase aqueuse (supérieure) : contient l'ARN.
- Interphase : ADN et protéines.
- Phase organique (inférieure) : protéines et lipides.
L'ARN est ensuite précipité de la phase aqueuse par l'isopropanol, lavé à l'éthanol 70 % et resuspendu dans de l'eau DEPC ou du tampon TE. Cette méthode donne un ARN de haute pureté, exempt de contaminants protéiques et d'ADN, utilisable pour les applications aval (RT‑PCR, Northern blot, séquençage d'ARN, etc.).
3. Protocole simplifié d'extraction d'ARN par Trizol
- Culture bactérienne : cultiver les bactéries jusqu'à la phase exponentielle (OD600 ~0,5‑1,0).
- Récupération du culot : centrifuger 5 min à 6000 tr/min, laver avec du PBS stérile.
- Lyse au Trizol : remettre le culot en suspension dans 1 mL de Trizol pour 10⁷‑10⁸ cellules.
- Incubation : incuber 5 min à température ambiante.
- Extraction au chloroforme : ajouter 0,2 mL de chloroforme, agiter 15 s, incuber 2‑3 min.
- Centrifugation : 12 000 g pendant 10 min à 4 °C.
- Récupération de la phase aqueuse : transférer la phase supérieure dans un nouveau tube.
- Précipitation : ajouter 0,5 volume d'isopropanol, incuber 10 min, centrifuger 10 min à 12 000 g.
- Lavage : laver le culot avec 1 mL d'éthanol 75 % (eau DEPC), centrifuger, éliminer l'éthanol.
- Séchage et resuspension : sécher à l'air, dissoudre dans 50‑100 µL d'eau DEPC ou tampon TE.
La concentration et la pureté sont vérifiées par spectrophotométrie (A260/A280 ≥ 1,8) et par électrophorèse sur gel (bandes 23S et 16S).
4. Applications de l'ARN extrait
- RT‑PCR et qPCR : quantification de l'expression génique (ADNc et RT‑PCR).
- Séquençage d'ARN (RNA‑seq) pour l'étude du transcriptome.
- Northern blot : détection d'ARN spécifiques.
- Synthèse d'ADNc pour le clonage ou la construction de banques.
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