Amplification du Gène ARNr 16S par PCR et Identification Bactérienne
Dernière mise à jour : | Par Abdelmalek
Principe d'amplification de gène 16S par PCR
La base moléculaire de l'identification des espèces bactériennes porte sur l'amplification et le séquençage du gène de l'ARNr 16S, puis sur leur comparaison avec la base de données existante. La comparaison des séquences de gènes ARNr pour l'identification des bactéries a été initiée par Carl Woese qui a redéfini la lignée principale dans l'évolution des microorganismes. Le principal avantage de la comparaison des séquences de gènes d'ARNr est la création d'une base de données de plus en plus étendue disponible dans le monde entier. Près de 60 000 séquences de gènes d'ARNr 16S sont actuellement disponibles dans le projet de base de données ribosomiques (RDP II). Le concept de comparaison des séquences de gènes des communautés microbiennes a révolutionné l'écologie microbienne.
Rôle de l'ARNr 16S dans l'identification bactérienne
L'ARN ribosomique 16S est un composant de la petite sous-unité 30S du ribosome procaryote ayant une longueur d'environ 1,542 kb. Les raisons de l'utilisation de l'amplification du gène de l'ARNr 16S à des fins d'identification incluent notamment :
- La présence universelle de ce gène dans tous les organismes procaryotes remplissant la même fonction biologique.
- Une structure de séquence alternant des régions hautement conservées (utiles pour fixer les amorces universelles) et des régions variables à hypervariables (spécifiques à chaque espèce).
- Une taille idéale d'environ 1500 pb, relativement facile à séquencer et suffisamment grande pour contenir l'information phylogénétique nécessaire à une identification précise.
Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
La PCR (Réaction en chaîne par polymérase) permet la synthèse à progression exponentielle de séquences d'ADN cibles définies in vitro.
Cette technique a été inventée par Kary Mullis en 1983, une découverte récompensée par le prix Nobel de chimie en 1993. La réaction est qualifiée de "polymérase" car l'enzyme centrale utilisée est une ADN polymérase thermostable (comme la Taq polymérase). Elle est dite "en chaîne" car les amplicons générés lors du premier cycle servent de matrice pour les cycles suivants. Le processus repose sur des cycles thermiques répétés alternant trois étapes clés : la dénaturation thermique de l'ADN double brin, l'hybridation des amorces spécifiques, et l'élongation enzymatique.
Applications de la PCR dans la recherche et la médecine
Les applications de la PCR sont omniprésentes en recherche biologique, en médecine diagnostique, pour le suivi des maladies infectieuses ainsi qu'en médecine légale. Lorsque la séquence des deux amorces encadrant la zone cible est connue, la PCR permet de dupliquer et d'isoler n'importe quel fragment d'ADN d'intérêt.
Le séquençage génomique, le clonage moléculaire et l'établissement d'empreintes génétiques sont directement facilités par cette méthodologie. De plus, de nombreuses variantes optimisées étendent ses capacités, telles que la PCR multiplex, la PCR en temps réel (qPCR), la PCR imbriquée (Nested-PCR), la RT-PCR (transcription inverse couplée à la PCR) ou encore la PCR numérique (dPCR).
