Procédure et protocole d'extraction d'ADN génomique bactérien

L'extraction d'ADN génomique bactérien est une étape préalable indispensable à de nombreuses applications de biologie moléculaire (PCR, séquençage, clonage, Southern blot). Le protocole décrit ci‑dessous suit une approche combinant une lyse enzymatique et chimique (SDS + protéinase K), une élimination des protéines par extraction liquide‑liquide (PCI), et une précipitation sélective à l'isopropanol. Ce protocole donne un rendement typique de 5 à 20 µg d'ADN par mL de culture saturée (10⁸‑10⁹ cellules/mL).

📋 Protocole détaillé (extraction d'ADN génomique bactérien)

1. Culture bactérienne : Cultiver 5 mL de bactéries jusqu’à saturation (généralement 16‑18 h à 37 °C sous agitation). Centrifuger 1,5 mL de cette culture à 6000 tr/min pendant 2 min (ou jusqu’à formation d’un culot compact).
2. Resuspension : Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 567 µL de tampon TE (Tris‑EDTA, pH 8,0). Le TE protège l’ADN des nucléases.
3. Lyse enzymatique et déprotéinisation : Ajouter 30 µL de SDS 10 % (détergent anionique qui solubilise les membranes) et 3 µL de protéinase K (20 mg/mL). Mélanger et incuber 1 h à 37 °C. La protéinase K dégrade les protéines et inactive les DNases.
4. Précipitation des sels et des débris : Ajouter 100 µL de NaCl 5 M et mélanger. Le NaCl favorise la précipitation des protéines‑SDS et neutralise les charges de l’ADN. Une concentration finale en NaCl < 0,5 M peut entraîner la précipitation de l’ADN avec les protéines – respecter cette étape.
5. Extraction au chloroforme/alcool isoamylique (24:1) : Ajouter 1 volume (environ 0,7‑0,8 mL) de mélange chloroforme:alcool isoamylique (24:1). Bien mélanger, centrifuger 5 min à 6000 tr/min. Transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un nouveau tube.
6. Extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) : Ajouter 1 volume du mélange phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1). Extraire vigoureusement, centrifuger 5 min à 6000 tr/min. Transférer à nouveau la phase aqueuse dans un tube frais. Cette étape élimine efficacement les protéines résiduelles.
7. Précipitation de l’ADN par l’isopropanol : Ajouter 0,6 volume d’isopropanol à la phase aqueuse, mélanger doucement jusqu’à apparition d’un précipité blanchâtre (ADN). Centrifuger 10 min à 10 000 tr/min à température ambiante. Éliminer le surnageant.
8. Lavage à l’éthanol 70 % : Ajouter 100 µL d’éthanol 70 % (froid) pour rincer le culot et éliminer les sels résiduels. Centrifuger 5 min à température ambiante, puis retirer l’éthanol.
9. Séchage du culot : Laisser sécher le culot à l’air libre (environ 10‑15 min) jusqu’à disparition complète de l’éthanol. Ne pas surmener (l’ADN deviendrait difficile à solubiliser).
10. Solubilisation : Reprendre le culot sec dans 50 µL de tampon TE (ou eau ultrapure). Laisser incuber 5 min à 55 °C si nécessaire. Le rendement typique est de 5‑20 µg d’ADN par mL de culture de départ.
11. Contrôle qualité : Vérifier la pureté et l’intégrité de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose (bande de haut poids moléculaire) et par spectrophotométrie (NanoDrop) : le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ doit être compris entre 1,8 et 2,0. Stocker l’ADN à 4 °C (court terme) ou à -20 °C.

📌 Points clés de réussite

• Qualité de la culture : Utiliser une culture fraîche en phase exponentielle tardive.
• Protéinase K : Essentielle pour dégrader les protéines et inactiver les nucléases ; ne pas omettre.
• NaCl 5 M : Une concentration insuffisante en sel empêche la précipitation sélective des protéines‑SDS et peut conduire à une perte d’ADN.
• PCI (phénol/chloroforme) : Manipuler sous hotte, utiliser du phénol équilibré (pH 8,0) pour extraire l’ADN (l’ARN reste dans la phase aqueuse).
• Isopropanol : Plus efficace que l’éthanol pour concentrer l’ADN à partir de grands volumes (0,6 volume suffit).
• Lavage à l’éthanol 70 % : Élimine les sels résiduels ; un lavage insuffisant peut inhiber les enzymes en aval (PCR, restriction).